Розробка складу та технології ліпосомальної комплексної композиції гідрофобних антиоксидантів мембранопротекторної дії
Вантажиться...
Дата
2021
Автори
ORCID
DOI
Науковий ступінь
доктор філософії
Рівень дисертації
Шифр та назва спеціальності
162 – Біотехнології та біоінженерія
Рада захисту
Спеціалізована вчена рада ДФ 64.050.033
Установа захисту
Національний технічний університет "Харківський політехнічний інститут"
Науковий керівник
Краснопольський Юрій Михайлович
Члени комітету
Видавець
Національний технічний університет "Харківський політехнічний інститут"
Анотація
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії за спеціальністю 162 "Біотехнології та біоінженерія". – Національний технічний університет "Харківський політехнічний інститут", Харків, 2021.
Дисертація присвячена розробці складу та технології ліпосомальної комплексної композиції гідрофобних антиоксидантів мембранопротекторної дії, зокрема для застосування у кардіології. Об’єктом дослідження є ліпосомальні композиції куркуміну та кверцетину на основі фосфатидилхоліну. Предметом дослідження є наукове обґрунтування та експериментальне підтвердження технології отримання ліпосомальної композиції куркуміну та кверцетину на основі фосфатидилхоліну, розробка складу, технології та методик контролю якості; вивчення їх фармакологічної активності. У першому розділі розглянуто роль перекисного окислення біологічних мембран у розвитку захворювань різної етіології, зокрема у кардіології. Визначено складові антиоксидантної системи захисту та роль екзогенних антиоксидантів у боротьбі із оксидативним стресом. Проведено аналіз літературних джерел щодо фармакологічної активності біофлавоноїдів куркуміну та кверцетину, зокрема антиоксидантної, мембранопротекторної, кардіопротекторної, протипухлинної та ін. Розглянуто питання перспективності створення комплексних ліпосомальних антиоксидантних препаратів, що дозволяє підвищити ефективність лікування за рахунок синергізму діючих речовин – куркуміну, кверцетину, ресвератролу, вітаміну D3, леводопа та ін. Підтверджено перспективність розробки ліпосомальних форм гідрофобних антиоксидантів з метою підвищення біодоступності та створення ін’єкційної лікарської форми та показано конкурентоспроможність ліпосомальних форм на ринку. Розглянуто технологічні принципи отримання ліпосомальних форм препаратів: способи одержання ліпосом, їх переваги та недоліки, вимоги до контролю якості ліпосомальних форм відповідно до нормативної документації. У другому розділі обґрунтована загальна схема розробки комплексної ліпосомальної композиції гідрофобних антиоксидантів та сформульовано основні етапи біотехнологічного дослідження. Наведено характеристику діючих та допоміжних речовин, що використовувались при розробці ліпосомальної композиції, та наведено вимоги якості відповідно до нормативної документації. Визначено технологічні методи одержання ліпосом, методи контролю якості та оцінки специфічної активності ліпосомальної композиції гідрофобних антиоксидантів. У третьому розділі наведено результати експериментальних досліджень з розробки технології одержання екстракту куркуміну. Досліджено показники якості рослинної сировини (порошку кореневища Curcuma longa L.) для одержання екстракту куркуміну та підтверджено їх відповідність специфікації виробника. Вивчено розчинність куркуміну в органічних розчинниках. Встановлені оптимальні режими екстрагування сумарної фракції куркуміноїдів: статична екстракція при температурі 50±2 ºС протягом 3–4 годин із використанням етанолу 96% із додаванням 1% 0,1 М хлоридної кислоти. Визначено оптимальні умови очистки куркуміну шляхом осадження водним розчином ацетону, режими формування осаду та центрифугування. Обрано умови проведення колоночної хроматографії з метою отримання високоочищеної фракції куркуміноїдів та спосіб їх ідентифікації методом ВЕРХ. Розроблено технологічну схему одержання екстракту куркуміну, яка включає очистку сировини гексаном від ліпофільних домішок, отримання неочищеного екстракту, переосадження водним розчином ацетону, колоночну хроматографію на силікагелі, що забезпечує вихід 1,0±0,2% із вмістом куркуміну не менше 98%. Розроблено специфікацію на екстракт куркуміну згідно вимог ДФУ. У четвертому розділі наведено результати експериментальних досліджень з розробки біотехнології ліпосомальної форми куркуміну. Досліджено показники якості фармацевтичних субстанцій фосфоліпідів та підтверджено їх відповідність специфікації виробника. Теоретично обґрунтовано та експериментально встановлено оптимальний склад ліпосомальної форми куркуміну, що забезпечує максимальний ступінь інкапсуляції куркуміну та задовільні технологічні характеристики – швидкість стерилізуючої фільтрації, стабільність емульсії. Співвідношення куркумін : фосфоліпіди у розробленій композиції становить 1 : 40, фосфоліпіди представлені фосфатидилхоліном яєчного жовтку та дипальмітоїлфосфатидилгліцерином у співвідношенні 10 : 1. Встановлено оптимальний технологічний режим проведення гомогенізації – 3 цикли при 500 Bar та 5 циклів при 800 Bar, що дозволяє отримати ліпосоми із розміром не більше 150 нм і ступенем інкапсуляції не менше 85%. Розроблено технологію одержання ліпосомальної форми куркуміну, яка включає одержання плівки ліпідів та куркуміну, ресуспендування плівки буферним розчином із стабілізатором, гомогенізацію високим тиском та стерилізуючу фільтрацію. Розроблено специфікацію на ліпосомальну форму куркуміну відповідно до вимог ДФУ. Проведено скринінгове дослідження токсичності та антиоксидантної активності ліпосомальної форми куркуміну на моделі оксидативного стресу Paramecium caudatum у порівнянні із відомими антиоксидантами у ліпосомальній формі (кверцетином, убіхіноном, цитохромом С). Досліджено вплив аніонного фосфоліпіду дипальмітоїлфосфатидилгліцерину у складі ліпосомальної мембрани на токсичність ліпосомальної композиції для культури Paramecium caudatum. Підтверджено антиоксидантну активність ліпосомальних форм куркуміну, кверцетину та убіхінону. У п’ятому розділі наведено результати експериментальних досліджень з розробки біотехнології комплексної ліпосомальної композиції гідрофобних антиоксидантів, що містить куркумін та кверцетин. Проведено дослідження показників якості фармацевтичної субстанції кверцетину та підтверджено її відповідність специфікації виробника. Удосконалено склад ліпосомальної форми кверцетину, що забезпечує високий ступінь інкапсуляції кверцетину та задовільні технологічні характеристики – швидкість стерилізуючої фільтрації, стабільність емульсії. Співвідношення кверцетин : фосфоліпіди у розробленій композиції становить 1 : 40, фосфоліпіди представлені фосфатидилхоліном яєчного жовтку та дипальмітоїлфосфатидилгліцерином у співвідношенні 10 : 1. Розроблено технологію одержання комплексної ліпосомальної композиції гідрофобних антиоксидантів, що містить куркумін та кверцетин, яка включає три етапи: одержання наноемульсії куркуміну із розміром наночастинок не більше 150 нм та ступенем включення не менше 85%; одержання наноемульсії кверцетину із розміром наночастинок не більше 150 нм та ступенем включення не менше 90%; одержання комплексної ліпосомальної композиції гідрофобних антиоксидантів шляхом об’єднання наноемульсій куркуміну та кверцетину, гомогенізації високим тиском, стерилізуючій фільтрації та ліофілізації. Встановлено оптимальний технологічний режим проведення гомогенізації об’єднаної композиції – 2 цикли при 500 Bar, що дозволяє отримати ліпосоми із розміром не більше 180 нм і ступенем інкапсуляції куркуміну не менше 85% і кверцетину не менше 90%. Досліджено процес ліофілізації комплексної ліпосомальної композиції гідрофобних антиоксидантів, що містить куркумін та кверцетин. Розроблено специфікацію на комплексну ліпосомальну композицію гідрофобних антиоксидантів, що містить куркумін та кверцетин, відповідно до вимог ДФУ. Вивчено стабільність комплексної ліпосомальної композиції гідрофобних антиоксидантів, ліофілізат для приготування розчину для інфузій, 15 мг у флаконі протягом 12 місяців та підтверджено відповідність показників якості препарату специфікації. У шостому розділі наведено результати експериментальних досліджень з вивчення фармакологічної активності комплексної ліпосомальної композиції гідрофобних антиоксидантів. Проведено вивчення фармакологічної активності комплексної ліпосомальної композиції гідрофобних антиоксидантів, що містить куркумін та кверцетин, відносно маркерів оксидативного стресу на моделі ішемічної хвороби серця щурів. Проведено порівняння розробленого препарату із монопрепаратами куркуміну та кверцетину у ліпосомальній формі, та підтверджено синергетичний ефект куркуміну та кверцетину при введенні у комплексі відносно досліджуваних маркерів оксидативного стресу у порівнянні із монопрепаратами, що містять лише один антиоксидант.
The thesis is submitted to obtain a scientific degree of Doctor of Philosophy, specialty 162 "Biotechnologies and bioengineering". – National Technical University “Kharkiv Polytechnic Institute”, Kharkiv, 2021. The thesis is devoted to the development of formulation and technology of the membrane protective liposomal complex composition of hydrophobic antioxidants, in particular for use in cardiology. The object of the research are liposomal compositions of curcumin and quercetin based on phosphatidylcholine. The subject of the research are scientific basis and experimental confirmation of the technology of the liposomal composition of curcumin and quercetin based on phosphatidylcholine, a development of the formulation, technology and quality-control techniques; a study of their pharmacological activity. The first section deals with the role of peroxidation of biological membranes in the development of diseases of various etiologies, in particular in cardiology. The components of the antioxidant defense system and the role of exogenous antioxidants in fighting the oxidative stress are determined. The analysis of literature data on the pharmacological activity of the bioflavonoids curcumin and quercetin, in particular antioxidant, membrane-protective, cardioprotective, antitumor, etc. was carried out. The question of the prospects of complex liposomal antioxidant drugs creation in order to increase the effectiveness of treatment due to the synergism of active substances, such as curcumin, quercetin, resveratrol, vitamin D3, levodopa, etc. was considered. The prospects of liposomal forms of hydrophobic antioxidants creation in order to increase the bioavailability and create injectable dosage forms were confirmed, and the market competitiveness of liposomal forms was shown. Technological principles of liposomal forms of drugs production were considered: methods for liposomes production, their advantages and disadvantages, requirements for quality control of liposomal forms in accordance with reference documentation. In the second section the general scheme of development of the complex liposomal composition of hydrophobic antioxidants was substantiated and the main stages of biotechnological research were formulated. The characteristic of active and auxiliary substances used in the development of liposomal composition was given, and the quality requirements in accordance with reference documentation were discussed. Technological methods of liposomes production, quality-control techniques and methods of specific activity evaluation of liposomal composition of hydrophobic antioxidants were determined. In the third section the results of experimental research on the development of technology of curcumin extract production were presented. The quality indicators of raw materials (powder of Curcuma longa L. rhizome) for the curcumin extract production were studied and their compliance with specifications of the manufacturer was confirmed. The solubility of curcuminoids in organic solvents was studied. The optimal modes of extraction of the total fraction of curcuminoids were established: static extraction at a temperature of 50±2 ºС for 3–4 hours using 96% ethanol with the addition of 1% 0.1 M hydrochloric acid. The optimal conditions for curcuminoids purification by precipitation with an aqueous solution of acetone, modes of sediment formation and centrifugation were determined. The conditions of column chromatography in order to obtain highly purified fractions of curcuminoids and the method of their identification by HPLC were selected. A technological scheme for curcumin extract production, which includes purification of raw materials with hexane from lipophilic impurities, obtaining of the crude extract, re-precipitation with an aqueous solution of acetone, column chromatography on silica gel was developed, that providing a yield of curcuminoids of 1,0±0,2% with content of it not less than 98%. A specification for the curcumin extract according to the requirements of State Pharmacopoeia of Ukraine was developed. The fourth section presents the results of experimental studies on the development of the biotechnology of the liposomal form of curcumin. The quality indicators of pharmaceutical substances of phospholipids were studied and their compliance with specifications of the manufacturer was confirmed. The optimal composition of the liposomal form of curcumin was theoretically substantiated and experimentally established, that provided the maximum degree of curcumin encapsulation and satisfactory technological characteristics, such as sterilizing filtration rate, emulsion stability. The ratio of curcumin to phospholipids in the developed composition was 1 to 40, phospholipids were represented by egg yolk phosphatidylcholine and dipalmitoylphosphatidylglycerol in a ratio of 10 to 1. The optimal technological mode of homogenization was established as 3 cycles at 500 Bar and 5 cycles at 800 Bar, which allows to obtain liposomes with a size of not more than 150 nm and a degree of encapsulation of not less than 85%. The developed technology for liposomal form of curcumin production included the stage of production film of lipid and curcumin, resuspending the film with a buffer solution with a stabilizer, high pressure homogenization and sterilizing filtration. A specification for the liposomal form of curcumin was developed in according to the requirements of State Pharmacopoeia of Ukraine. A screening study of the toxicity and antioxidant activity of the liposomal form of curcumin was performed on the model of oxidative stress of Paramecium caudatum in comparison with previously known liposomal form of antioxidants (quercetin, ubiquinone, cytochrome C). The effect of the anionic phospholipid dipalmitoylphosphatidylglycerol in the liposomal membrane formulation on the toxicity of the liposomal composition for the culture of Paramecium caudatum was studied. The antioxidant properties of liposomal forms of curcumin, quercetin and ubiquinone was confirmed. The fifth section presents the results of experimental studies on the development of the biotechnology for the complex liposomal composition of hydrophobic antioxidants containing curcumin and quercetin. The quality indicators of pharmaceutical substances of quercetin were studied and its compliance with specifications of the manufacturer was confirmed. The composition of the liposomal form of quercetin was improved, that provided a high degree of quercetin encapsulation and satisfactory technological characteristics, such as sterilizing filtration rate, emulsion stability. The ratio of quercetin to phospholipids in the developed composition was 1 to 40, phospholipids are represented by egg yolk phosphatidylcholine and dipalmitoylphosphatidylglycerol in a ratio of 10 to 1. The developed technology for the production of the complex liposomal composition of hydrophobic antioxidants containing curcumin and quercetin included three stages: production of the curcumin nanoemulsion with a nanoparticle size of not more than 150 nm and a degree of curcumin encapsulation of not less than 85%; production of the quercetin nanoemulsion with a nanoparticle size of not more than 150 nm and a degree of quercetin encapsulation of not less than 90%; production of the complex liposomal composition of hydrophobic antioxidants by combining of curcumin and quercetin nanoemulsions, high pressure homogenization, sterilizing filtration and lyophilization. The optimal technological mode of homogenization of the combined composition was 2 cycles at 500 Bar, that allows to obtain liposomes with a size of not more than 180 nm and a degree of curcumin encapsulation not less than 85% and a degree of curcumin encapsulation not less than 90%. The process of lyophilization of a complex liposomal composition of hydrophobic antioxidants containing curcumin and quercetin was studied. A specification for the complex liposomal composition of hydrophobic antioxidants containing curcumin and quercetin was developed in according to the requirements of State Pharmacopoeia of Ukraine. The stability of the complex liposomal composition of hydrophobic antioxidants in a form of lyophilisate for preparation of infusion solution (15 mg in a vial) for 12 months was studied and the compliance of the quality indicators of the drug to the specification was confirmed. In the sixth section the results of experimental studies of pharmacological activity of the complex liposomal composition of hydrophobic antioxidants were presented. The pharmacological activity of the complex liposomal composition of hydrophobic antioxidants containing curcumin and quercetin against oxidative stress markers in a model of ischemic heart disease in rats. The developed drug is compared with the monopreparations of curcumin and quercetin in liposomal form, and the synergistic effect of curcumin and quercetin in a complex form with respect to studied oxidative stress markers was confirmed in comparison with monopreparations containing only one antioxidant.
The thesis is submitted to obtain a scientific degree of Doctor of Philosophy, specialty 162 "Biotechnologies and bioengineering". – National Technical University “Kharkiv Polytechnic Institute”, Kharkiv, 2021. The thesis is devoted to the development of formulation and technology of the membrane protective liposomal complex composition of hydrophobic antioxidants, in particular for use in cardiology. The object of the research are liposomal compositions of curcumin and quercetin based on phosphatidylcholine. The subject of the research are scientific basis and experimental confirmation of the technology of the liposomal composition of curcumin and quercetin based on phosphatidylcholine, a development of the formulation, technology and quality-control techniques; a study of their pharmacological activity. The first section deals with the role of peroxidation of biological membranes in the development of diseases of various etiologies, in particular in cardiology. The components of the antioxidant defense system and the role of exogenous antioxidants in fighting the oxidative stress are determined. The analysis of literature data on the pharmacological activity of the bioflavonoids curcumin and quercetin, in particular antioxidant, membrane-protective, cardioprotective, antitumor, etc. was carried out. The question of the prospects of complex liposomal antioxidant drugs creation in order to increase the effectiveness of treatment due to the synergism of active substances, such as curcumin, quercetin, resveratrol, vitamin D3, levodopa, etc. was considered. The prospects of liposomal forms of hydrophobic antioxidants creation in order to increase the bioavailability and create injectable dosage forms were confirmed, and the market competitiveness of liposomal forms was shown. Technological principles of liposomal forms of drugs production were considered: methods for liposomes production, their advantages and disadvantages, requirements for quality control of liposomal forms in accordance with reference documentation. In the second section the general scheme of development of the complex liposomal composition of hydrophobic antioxidants was substantiated and the main stages of biotechnological research were formulated. The characteristic of active and auxiliary substances used in the development of liposomal composition was given, and the quality requirements in accordance with reference documentation were discussed. Technological methods of liposomes production, quality-control techniques and methods of specific activity evaluation of liposomal composition of hydrophobic antioxidants were determined. In the third section the results of experimental research on the development of technology of curcumin extract production were presented. The quality indicators of raw materials (powder of Curcuma longa L. rhizome) for the curcumin extract production were studied and their compliance with specifications of the manufacturer was confirmed. The solubility of curcuminoids in organic solvents was studied. The optimal modes of extraction of the total fraction of curcuminoids were established: static extraction at a temperature of 50±2 ºС for 3–4 hours using 96% ethanol with the addition of 1% 0.1 M hydrochloric acid. The optimal conditions for curcuminoids purification by precipitation with an aqueous solution of acetone, modes of sediment formation and centrifugation were determined. The conditions of column chromatography in order to obtain highly purified fractions of curcuminoids and the method of their identification by HPLC were selected. A technological scheme for curcumin extract production, which includes purification of raw materials with hexane from lipophilic impurities, obtaining of the crude extract, re-precipitation with an aqueous solution of acetone, column chromatography on silica gel was developed, that providing a yield of curcuminoids of 1,0±0,2% with content of it not less than 98%. A specification for the curcumin extract according to the requirements of State Pharmacopoeia of Ukraine was developed. The fourth section presents the results of experimental studies on the development of the biotechnology of the liposomal form of curcumin. The quality indicators of pharmaceutical substances of phospholipids were studied and their compliance with specifications of the manufacturer was confirmed. The optimal composition of the liposomal form of curcumin was theoretically substantiated and experimentally established, that provided the maximum degree of curcumin encapsulation and satisfactory technological characteristics, such as sterilizing filtration rate, emulsion stability. The ratio of curcumin to phospholipids in the developed composition was 1 to 40, phospholipids were represented by egg yolk phosphatidylcholine and dipalmitoylphosphatidylglycerol in a ratio of 10 to 1. The optimal technological mode of homogenization was established as 3 cycles at 500 Bar and 5 cycles at 800 Bar, which allows to obtain liposomes with a size of not more than 150 nm and a degree of encapsulation of not less than 85%. The developed technology for liposomal form of curcumin production included the stage of production film of lipid and curcumin, resuspending the film with a buffer solution with a stabilizer, high pressure homogenization and sterilizing filtration. A specification for the liposomal form of curcumin was developed in according to the requirements of State Pharmacopoeia of Ukraine. A screening study of the toxicity and antioxidant activity of the liposomal form of curcumin was performed on the model of oxidative stress of Paramecium caudatum in comparison with previously known liposomal form of antioxidants (quercetin, ubiquinone, cytochrome C). The effect of the anionic phospholipid dipalmitoylphosphatidylglycerol in the liposomal membrane formulation on the toxicity of the liposomal composition for the culture of Paramecium caudatum was studied. The antioxidant properties of liposomal forms of curcumin, quercetin and ubiquinone was confirmed. The fifth section presents the results of experimental studies on the development of the biotechnology for the complex liposomal composition of hydrophobic antioxidants containing curcumin and quercetin. The quality indicators of pharmaceutical substances of quercetin were studied and its compliance with specifications of the manufacturer was confirmed. The composition of the liposomal form of quercetin was improved, that provided a high degree of quercetin encapsulation and satisfactory technological characteristics, such as sterilizing filtration rate, emulsion stability. The ratio of quercetin to phospholipids in the developed composition was 1 to 40, phospholipids are represented by egg yolk phosphatidylcholine and dipalmitoylphosphatidylglycerol in a ratio of 10 to 1. The developed technology for the production of the complex liposomal composition of hydrophobic antioxidants containing curcumin and quercetin included three stages: production of the curcumin nanoemulsion with a nanoparticle size of not more than 150 nm and a degree of curcumin encapsulation of not less than 85%; production of the quercetin nanoemulsion with a nanoparticle size of not more than 150 nm and a degree of quercetin encapsulation of not less than 90%; production of the complex liposomal composition of hydrophobic antioxidants by combining of curcumin and quercetin nanoemulsions, high pressure homogenization, sterilizing filtration and lyophilization. The optimal technological mode of homogenization of the combined composition was 2 cycles at 500 Bar, that allows to obtain liposomes with a size of not more than 180 nm and a degree of curcumin encapsulation not less than 85% and a degree of curcumin encapsulation not less than 90%. The process of lyophilization of a complex liposomal composition of hydrophobic antioxidants containing curcumin and quercetin was studied. A specification for the complex liposomal composition of hydrophobic antioxidants containing curcumin and quercetin was developed in according to the requirements of State Pharmacopoeia of Ukraine. The stability of the complex liposomal composition of hydrophobic antioxidants in a form of lyophilisate for preparation of infusion solution (15 mg in a vial) for 12 months was studied and the compliance of the quality indicators of the drug to the specification was confirmed. In the sixth section the results of experimental studies of pharmacological activity of the complex liposomal composition of hydrophobic antioxidants were presented. The pharmacological activity of the complex liposomal composition of hydrophobic antioxidants containing curcumin and quercetin against oxidative stress markers in a model of ischemic heart disease in rats. The developed drug is compared with the monopreparations of curcumin and quercetin in liposomal form, and the synergistic effect of curcumin and quercetin in a complex form with respect to studied oxidative stress markers was confirmed in comparison with monopreparations containing only one antioxidant.
Опис
Ключові слова
дисертація, ліпосомальні наночастинки, біомембрана, фосфоліпіди, гідрофобні антиоксиданти, біофлавоноїди, куркумін, кверцетин, технологія одержання ліпосом, метод ліпідної плівки, гомогенізація високим тиском, стерилізуюча фільтрація, ліофілізація, антиоксидантна активність, біотестування, ішемічна хвороба серця, liposomal nanoparticles, biomembrane, phospholipids, hydrophobic antioxidants, bioflavonoids, curcumin, quercetin, liposome production technology, lipid film method, high pressure homogenization, sterilizing filtration, lyophilization, antioxidant activity, biotesting, ischemic heart disease
Бібліографічний опис
Пилипенко Д. М. Розробка складу та технології ліпосомальної комплексної композиції гідрофобних антиоксидантів мембранопротекторної дії [Електронний ресурс] : дис. ... д-ра філософії : спец. 162 : галузь знань 16 / Дар'я Михайлівна Пилипенко ; наук. керівник Краснопольський Ю. М. ; Нац. техн. ун-т "Харків. політехн. ін-т". – Харків, 2021. – 228 с. – Бібліогр.: с. 173-205. – укр.