Оптимізація параметрів відмивки бактеріальних клітин та тілець включення у виробництві рекомбінантного інсуліну людини - Волошина, Ірина Миколаївна; Грецький, І. О.; Мокроусова, О. Р.; Хейломський, Д. О. (Національний технічний університет "Харківський політехнічний інститут", 2026)
В роботі представлено результати досліджень оптимізації параметрів процеси відмивки бактеріальних клітин штаму генно-модифікованого штаму-продуценту рекомбінантного інсуліну людини на основі Escherichia coli BL21 від компонентів культурального середовища та відмивки виділених в результаті руйнування зазначених бактеріальних клітин тілець включення від компонентів цитоплазми й клітинного дебрісу. Обгрунтовано доцільність досліджень щодо технологічності, виходу та якості очищення цільового продукту на подальших етапах даунстрім-процесу біотехнологічного виробництва рекомбінантного інсуліну людини. В результаті проведених досліджень показано, що діапазони швидкості подачі суспензії на відцентровий сепаратор з автоматичним вивантаженням 300–650 л/г та часу між вивантаженнями 250–350 С за максимальної швидкості обертання барабану 11700 об/хв визначають напрям оптимізації параметрів відцентрового розділення. В процесі оптимізації визначено потенційну причину виникнення високих пускових струмів мішалок в реакторах під час відмивки та розчинення гібридного білку перед рефолдінгом. Запропоновано альтернативні рішення зазначеної проблеми: використання ДНКази під час відмивки суспензії тілець включення або використання нового, потужнішого обладнання, конструкція якого враховує можливість виникнення високих пускових струмів. Результати досліджень дозволили запропонувати кореляцію порядків величин нормалізованої відмінності між значеннями в’язкості суспензій та вмістом в них сухого залишку для впровадження в якості індикатору якості концентрування тілець включення для контролю біопроцесу. В модельних експериментах досліджено вплив ПАР під час відмивки тілець включення на повноту видалення нуклеїнових кислот, відсутність втрат продукту при відмивці, та повноту розчинення тілець включення перед рефолдінгом. Найбільший рівень повноти розчинення (83,21 %) встановлено після відмивки тілець включення розчином ПАРROKwinol80. Результати досліджень окреслити простір дизайну оптимальних параметрів відцентрового розділення відповідно до фактичних виробничих умов. За результатними оцінювання параметрів в’язкості технологічних середовищ запропоновано гіпотезу та потенційні шляхи оптимізації параметрів експлуатації ємнісного обладнання. Сформовано перспективні напрямки подальших досліджень щодо кількісного аналізу впливу ПАР на видалення нуклеїнових кислот та застосування специфічних ферментів для їх гідролізу у складі відмивочних розчинів.

The paper presents the results of research on the optimisation of the parameters of the washing process of bacterial cells of the genetically modified strain producing recombinant human insulin based on Escherichia coli BL21 from the components of the culture medium and washing of inclusion bodies isolated as a result of the destruction of the specified bacterial cells from the components of the cytoplasm and cell debris. The feasibility of research on the technological aspects, yield, and quality of purification of the target product at subsequent stages of biotechnological recombinant human insulin production is substantiated. The research has shown that the ranges of suspension feed rates to a centrifugal separator with automatic unloading, 300–650 l/h, and the time between unloading, 250–350 s, at a maximum drum rotation speed of 11,700 rpm, determine the direction of optimisation of the centrifugal separation parameters. During the optimisation process, the potential cause of high starting currents in agitators of reactors during the washing and dissolution of hybrid proteins before refolding was identified. Alternative solutions to this problem were proposed, including the use of DNase during the washing of inclusion body suspensions and the development of new, more powerful equipment that takes into account the possibility of high starting currents. The research results enabled the proposal of a correlation between the orders of magnitude of the normalized difference in viscosity values between suspensions and their dry residue content, which can serve as an indicator of the quality of inclusion body concentration for bioprocess control. In model experiments, the influence of surfactants on the completeness of nucleic acid removal during the washing of inclusion bodies, the absence of product loss during washing, and the completeness of dissolution of inclusion bodies before refolding was investigated. The highest level of dissolution completeness (83.21 %) was established after washing the inclusion bodies with ROKwinol80 surfactant solution. The research results outline the design space for optimal centrifugal separation parameters in accordance with actual production conditions. Based on the results of the assessment of the viscosity parameters of technological media, a hypothesis and potential ways to optimise the operating parameters of capacitive equipment were proposed. Promising directions for further research have been identified regarding the quantitative analysis of the effect of surfactants on the removal of nucleic acids and the use of specific enzymes for their hydrolysis in washing solutions.
Optimization of washing parameters for bacterial cells and inclusion bodies in the production of recombinant human insulin
Keywords: рекомбінантний інсулін; біопроцеси; оптимізація; сепарація; культура бактеріальних клітин; тільця включення; відмивка; recombinant insulin; bioprocesses; optimisation; separation; bacterial cul ture; inclusion bodies; washing