Методи тривимірної візуалізації плазматичних мембран еритроцитів для визначення морфологічних ознак

Abstract

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора філософії за спеціальністю 152 – Метрологія та інформаційно–вимірювальна техніка (15 – Автоматика та приладобудування). – Національний технічний університет "Харківський політехнічний інститут", Міністерство освіти та науки України, Харків, 2021. Об'єктом дослідження є вдосконалення способу визначення морфологічних ознак еритроцитів шляхом візуалізації тривимірного зображення з подальшим статистичним аналізом морфологічних змін для визначення ступеня їх функціональності. Предметом дослідження є тривимірні геометричні параметри морфології еритроцитів, які мають властивості змінюватися в залежності від стану пацієнта. В дисертаційній роботі вирішена науково–практична задача підвищення роздільної здатності тривимірного зображення еритроциту для визначення морфологічних параметрів за рахунок вдосконалення методу спектрального аналізу та засобів цифрового спектрометричного перетворення. Дослідження виконано за допомогою фундаментальних положень теоретичних основ геометричної та фізичної оптик, лазерної техніки , чисельного розв’язання рівнянь, сучасних інформаційних технологій. В якості основних інструментів для проведення чисельного моделювання представленого алгоритму розроблена програма на мові Python з використанням бібліотек Numpy і Open CV і програма, що дозволяє будувати і візуалізувати тривимірні моделі по двовимірним знімкам, яка працює під управлінням ОС Windows, написана на мові С ++. Для виведення 3D моделей використовується бібліотека Direct X і графічний прискорювач. У вступі обґрунтовано актуальність теми дисертації, визначені задачі дослідження, показано зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами, наведено дані про наукову новизну, практичне значення, апробацію результатів та публікації. У першому розділі для вивчення проблемної області та визначення напрямків досліджень проведено аналіз наявності діагностичних ознак на підставі динаміки морфологічних змін еритроцитів і проаналізовані методи лабораторного мікроскопічного дослідження клітин периферичної крові. Також був проведений аналітичний огляд існуючих інтерферометрів з подальшим виявленням їх переваг і недоліків. На підставі проведених досліджень був вибраний оптимальний по суті і способу реалізації заданої мети метод інтерференційної мікроскопії, який дозволить отримати тривимірні зображення еритроцитів поліпшеної якості за рахунок цільової оптимізації та модернізації предметного і опорного пучків променів. У другому розділі обґрунтовано вибір та розташування оптичних елементів принципової схеми, яка дозволила отримати більш точне зображення еритроцитів за рахунок зв’язку між роздільною здатністю системи та кутом між опорним та об’єктним пучками променів, що дало можливість зафіксувати більше кілець навколо інтерференційного зображення еритроцитів. Розроблена оптична схема пристрою, яка має можливість будувати зображення двопроменевої інтерференційної картини при введенні оптичного модулятора, що вирівнює довжину оптичного шляху опорного та об'єктного пучків променів та багатопроменевої інтерференції при використанні камери Горяєва. Принцип роботи розробленого пристрою заснований на тому, що прозорі мікрооб'єкти змінюють фазу світла, що проходить крізь них, так як мають свій показник заломлення, відмінний від показника заломлення навколишнього середовища і через складність структури таких об'єктів, світлова хвиля, що пройшла крізь них, набуває фазовий характер. В основу проектування принципової оптичної схеми була покладена задача отримання інтерференції шляхом поділу пучка променів на дві гілки, розміщення в одній з них мікроскопа і зведення пучків світла на пластині з подальшою фіксацією зображення цифровою камерою і виведенням на монітор комп'ютера. Додатково для спрощення процесу дослідження еритроцитів та підвищення його технологічності була розроблена принципова оптична схема інтерференційного мікроскопу з можливістю отримання різних ступенів збільшення без перефокусування. Для цього було запропоновано застосувати дві телескопічні системи Галілея з різними фокусними відстанями. Використання телескопічної системи Галілея дозволило досягти такого збільшення всією системою, яке можливо без цього елементи лише за умови використання імерсійного об'єктиву та мастила до нього. У третьому розділі було запропоновано обробити отримані в результаті експерименту інтерференційні зображення еритроцитів з метою визначення геометричних морфологічних характеристик застосувавши для побудови тривимірного зображення еритроцитів метод цифрової обробки сигналів на основі перетворення Фур'є, з накладанням смугового фільтру, метод візуалізації тривимірної форми об'єктів за двовимірними знімками та метод спектрального аналізу. Одним із способів отримання тривимірного зображення є метод на основі перетворення Фур'є, згідно з яким необхідно виконати перетворення Фур'є над зареєстрованим зображенням. Для цього була розроблена програма на мові Python з використанням бібліотек Numpy і Open CV. Для демонстрації роботи програми був розроблений алгоритм обробки зареєстрованого зображення. Другим способом побудови тривимірної моделі еритроцита є метод отримання тривимірних зображень за двовимірними знімками. Програма, що застосовується для даного методу, працює під управлінням ОС Windows, написана на мові С ++.Для виведення 3D моделей використовується бібліотека Direct X і графічний прискорювач. Основний алгоритм по карті щільності синтезує 3D сітку трикутників, що використовується для апроксимації поверхні, накладає на неї вибраний користувачем градієнт, закодований у вигляді 1D–текстури, як текстурної координати в розгортці використовується значення щільності. Після чого, отримана поверхня раструється за допомогою графічного прискорювача з обраного користувачем кута спостереження. Третім способом отримання тривимірного зображення еритроцитів є метод спектрального аналізу, сутність якого полягає в здатності молекул поглинати електромагнітне випромінювання. Характеризуючи спектри поглинання біомолекулами квантів світла, можна кількісно отримати інформацію про особливості будови мікрооб'єктів. Також були проведені дослідження метрологічних характеристик розробленого методу відновлення геометричних параметрів еритроцитів як методу їх непрямого вимірювання. У четвертому розділі була описана практична реалізація запропонованого вдосконаленого методу. Для здійснення перевірки висунутих припущень і отримання тривимірного зображення еритроцитів, на основі розробленої принципової оптичної схеми був зібраний експериментальний стенд. Для більш точного відображення інформації про морфології еритроцитів додатково був приведений розрахунок товщини інтерференційних смуг при заданій довжині хвилі випромінювання, кута між опорним і об'єктним пучками променів та роздільної здатності цифрової камери для фіксації зображення. Запропоновано дії зі зміни даного параметра. Детально описані етапи складання та юстування оптичної схеми інтерференційного мікроскопу. Для калібрування збільшення мікроскопа було запропоновано використовувати сітку камери Горяєва, в якій розмір великих та маленьких квадратів відомій. Для калібрування програми, що дозволяє відобразити тривимірне зображення еритроцитів з накладенням вертикальних и горизонтальних шкал, був зроблений знімок інтерференційної картини введеної плоскопаралельної пластини заданої товщина. В якості пластини використовували скло товщина 0,35 мм. Для проведення оптико-біологічних досліджень динаміки зміни форми еритроцитів був розроблений механізм екзогенного впливу на морфологію оболонки еритроцита. Для зміни форми еритроцитів була застосована здатність даних клітин змінювати форму під дією осмотичного тиску при розміщенні їх в різні по концентрації солей розчини. В дисертаційній роботі проведено комплекс теоретичних і практичних досліджень стосовно метода тривимірної візуалізації плазматичних мембран еритроцитів для визначення морфологічних ознак. Сукупність отриманих результатів роботи можна класифікувати, як розробку теоретичного забезпечення та вирішення важливої науково–прикладної задачі, що має вагоме значення в розвитку методів лабораторної діагностики відносно сучасних вимог медицини та нового напрямку в мікроскопії. Результати досліджень дозволили отримати низку наукових результатів: – Вперше за рахунок вдосконалення методу спектрального аналізу та засобів цифрового спектрометричного перетворення отримано тривимірне зображення еритроцитів, яке з підвищеною роздільною здатністю відображає інформацію про їх морфологічні параметри; – Отримано розвиток процесу спрощеного лабораторного дослідження стану плазматичних мембран еритроцитів і підвищена його технологічність за рахунок вдосконаленої принципової оптичної схеми інтерференційного мікроскопа з автоматизованою зміною збільшення і поліпшеними оптико-технічними характеристиками. Перевагами даного вдосконалення є забезпечення можливості отримання двопроменевої і багатопроменевої інтерференційної картини за рахунок динамічної зміни елементів оптичної схеми; – Вдосконалено математичний опис морфологічних ознак еритроцитів завдяки поєднанню метода інтерференційної мікроскопії в з методом цифрової обробки сигналів для тривимірної візуалізації фазових мікрооб'єктів за рахунок математичної статистичної обробки інтерференційного зображення; – Розроблено та виготовлено експериментальний стенд для одержання нової вимірювальної інформації відносно геометричних та морфологічних ознак клітин крові при використанні запропонованих технічних рішень, отриманих у дисертаційній роботі. Особливо треба відзначити можливість динамічної зміни елементів оптичної схеми, зменшені масогабаритні параметри та можливість визначення ефективних співвідношень конструктивних параметрів оптичних елементів і їх взаємного розташування з метою створення зображення еритроцитів поліпшеної якості.The dissertation on competition of a scientific degree of the doctor of philosophy on a specialty 152 - Metrology and information-measuring technics (15 – Automation and instrument making). – National Technical University "Kharkiv Polytechnic Institute", Ministry of Education and Science of Ukraine, Kharkiv, 2021. The object of the study is to improve the method of determining the morphological features of erythrocytes by visualizing a thre-edimensional image with subsequent statistical analysis of morphological changes to determine the degree of their functionality. The subject of the study are three-dimensional geometric parameters of erythrocyte morphology, which have the ability to vary depending on the patient's condition. In the dissertation work the scientific-practical problem of increase of resolution of the three-dimensional image of an erythrocyte for definition of morphological parameters due to improvement of a method of the spectral analysis and means of digital spectrometric transformation is solved. The research was performed with the help of the fundamental principles of the theoretical foundations of geometric and physical optics, laser technology, numerical solution of equations, modern information technologies. As the main tools for numerical simulation of the presented algorithm developed a program in Python using libraries Numpy and Open CV and a program that allows you to build and visualize three-dimensional models of two-dimensional images, running Windows, written in C ++. A Direct X library and a graphics accelerator are used to display 3D models. The introduction substantiates the relevance of the dissertation topic, defines the objectives of the study, shows the relationship of work with scientific programs, plans, topics, provides data on scientific novelty, practical significance, approbation of results and publications. In the first section to study the problem area and determine the directions of research, the analysis of the presence of diagnostic signs on the basis of the dynamics of morphological changes of erythrocytes and analyzed methods of laboratory microscopic examination of peripheral blood cells. An analytical review of existing interferometers was also conducted, followed by the identification of their advantages and disadvantages. On the basis of the studies carried out, the method of interference microscopy, which is optimal in essence and in the way of realizing a given goal, was chosen, which will allow obtaining three-dimensional images of erythrocytes of improved quality due to targeted optimization and modernization of the object and reference beams of rays. In the second section, the choice and location of the optical elements of the schematic diagram are substantiated, which made it possible to obtain a more accurate image of erythrocytes due to the connection between the resolution of the system and the angle between the reference and object beams of the rays, which made it possible to fix more interference rings around the image of erythrocytes. The developed optical scheme of the device has the ability to build images of a two-beam interference pattern with the introduction of an optical modulator, which equalizes the optical path length of the reference and object beams of rays and multi-beam interference when using a Goryaev camera. The principle of operation of the developed device is based on the fact that transparent micro–objects change the phase of light passing through them, since they have their own refractive index, which is different from the refractive index of the environment, and due to the complexity of the structure of such objects, the light wave passing through them acquires a phase character. The design of the basic optical scheme was based on the task of obtaining interference by dividing the beam of rays into two branches located in one of them of the microscope and converging the light beams on the plate, followed by fixing the image with a digital camera and displaying it on a computer monitor. In addition, to simplify the process of studying erythrocytes and improve its manufacturability, a basic optical scheme of an interference microscope was developed with the possibility of obtaining various degrees of magnification without refocusing. For this, it was proposed to use two Galilean telescopic systems with different focal lengths. The use of Galileo's telescopic system made it possible to achieve such an increase with the entire system, which is possible without this elements only if an immersion lens is used. In the third section, it was proposed to process the interference images of erythrocytes obtained as a result of the experiment in order to determine the geometric morphological characteristics. To construct a three-dimensional image of erythrocytes, we used the method of digital signal processing based on the Fourier transform, with the imposition of a band-pass filter, the method of visualizing the three-dimensional shape of objects using two-dimensional images and the method of spectral analysis. One of the ways to obtain a three-dimensional image is a method based on the Fourier transform, according to which it is necessary to perform the Fourier transform on the recorded image. For this, a Python program was developed using the Numpy and Open CV libraries. To demonstrate the operation of the program, an algorithm for processing the registered image was developed. The second method for constructing a three-dimensional model of an erythrocyte is the method of obtaining three-dimensional images from two-dimensional images. The program used for this method runs under Windows, written in C ++. The Direct X library and graphics accelerator are used to display 3D models. The basic algorithm for the density map synthesizes a 3D mesh of triangles, which is used to approximate the surface, superimposes a user-selected gradient, encoded as a 1D texture, as the texture coordinates in the sweep, the density values are used. After that, the resulting surface is rasterized using a graphics accelerator with a user-selected viewing angle. The third method of obtaining a three-dimensional image of erythrocytes is the method of spectral analysis, the essence of which is the ability of molecules to absorb electromagnetic radiation. By characterizing the absorption spectra of light quanta by biomolecules, one can quantitatively obtain information on the structural features of micro-objects. Also, studies were carried out on the metrological characteristics of the developed method for restoring the geometric parameters of erythrocytes as a method of their indirect measurement. In the fourth section, the practical implementation of the proposed improved method was described. To test the assumptions made and to obtain a three-dimensional image of erythrocytes, an experimental stand was assembled on the basis of the developed optical schematic diagram. For a more accurate display of information about the morphology of erythrocytes, the calculation of the thickness of the interference fringes at a given radiation wavelength, the angle between the reference and object beams of the rays and the resolution of a digital camera for image fixation was additionally given. Actions to change this parameter are proposed. The stages of drawing up and adjusting the optical scheme of an interference microscope are described in detail. To calibrate the magnification of the microscope, it was proposed to use the grid of the Goryaev camera, in which the size of large and small squares is known. To calibrate the program, which makes it possible to reflect a three-dimensional image of erythrocytes with overlapping vertical and horizontal scales, a snapshot of the interference pattern of an inserted plane-parallel plate of a given thickness was taken. Glass with a thickness of 0.35 mm was used as a plate. To conduct optical and biological studies of the dynamics of changes in the shape of erythrocytes, a mechanism of exogenous influence on the morphology of the erythrocyte membrane was developed. To change the shape of erythrocytes, the ability of these cells to change their shape under the influence of osmotic pressure was used when they are placed in solutions of various concentrations of salts. In the dissertation work, a complex of theoretical and practical studies of the method of three-dimensional visualization of plasma membranes of erythrocytes was carried out to determine morphological signs. The totality of the obtained results of the work can be classified as the development of theoretical support and the solution of an important scientific and applied problem, which is of great importance in the development of laboratory diagnostic methods in relation to the modern requirements of medicine and a new direction in microscopy. The research results allowed to obtain a number of scientific results: – For the first time, due to the improvement of the method of spectral analysis and means of digital spectrometric conversion, a three-dimensional image of erythrocytes was obtained, which displays information about their morphological parameters with an increased resolution; – The development of the process of a simplified laboratory study of the state of the plasma membranes of erythrocytes and its increased manufacturability due to an improved basic optical scheme of an interference microscope with an automated change in magnification and improved optical and technical characteristics has been obtained. The advantages of this improvement are to provide the possibility of obtaining a two-beam and multi-beam interference pattern by dynamically changing the elements of the optical scheme; – The mathematical description of the morphological features of erythrocytes has been improved due to the combination of the interference microscopy method with the digital signal processing method for three-dimensional visualization of phase micro-objects due to the mathematical statistical processing of the interference image; – An experimental stand has been developed and manufactured to obtain new measuring information regarding the geometric and morphological characteristics of blood cells using the proposed technical solutions obtained in the dissertation work. Especially it should be noted the possibility of dynamically changing the elements of the optical scheme, reduced weight and size parameters, as well as the possibility of determining the effective ratios of the design parameters of the optical elements and their mutual arrangement in order to create an image of erythrocytes of improved quality.